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蛋白質含量測定方法

更新時間:2010-11-10      點擊次數:10689

 

蛋白質含量測定方法一般來說,有以下五種:凱氏定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍法(Bradford法)。

五種蛋白質含量測定方法的比較

方法

靈敏度

時間

原理

干擾物質

說明

凱氏定氮法

(Kjedahl法)

靈敏度低,適用于0.2~ 1.0mg氮,誤差為 ±2%

費時

8~10小時

將蛋白氮轉化為氨,用酸吸收后滴定

非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離)

用于標準蛋白質含量的準確測定;干擾少;費時太長

雙縮脲法(Biuret法)

靈敏度低

1~20mg

中速

20~30分鐘

多肽鍵+堿性Cu2®紫色絡合物

硫酸銨;

Tris緩沖液;

某些氨基酸

用于快速測定,但不太靈敏;不同蛋白質顯色相似

紫外吸收法

較為靈敏

50~100mg

快速

5~10分鐘

蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收

各種嘌吟和嘧啶;

各種核苷酸

用于層析柱流出液的檢測;核酸的吸收可以校正

Folin-酚試劑法(Lowry法)

靈敏度高

~5mg

慢速

40~60

分鐘

雙縮脲反應;磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原

硫酸銨;

Tris緩沖液;

甘氨酸;

各種硫醇

耗費時間長;操作要嚴格計時;

顏色深淺隨不同蛋白質變化

考馬斯亮藍法(Bradford法)

靈敏度zui高

1~5mg

快速

5~15分鐘

考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時,其lmax由465nm變?yōu)?95nm

強堿性緩沖液;

TritonX-100;

SDS

的方法;

干擾物質少;

顏色穩(wěn)定;

顏色深淺隨不同蛋白質變化

      從以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特點和優(yōu)勢,如紫外吸收法測定時間快。但是綜合起來,zui后一種考馬斯亮藍法(Bradford法)效率zui高,無論是測定時間,靈敏度還是受干擾程度,都是比較占優(yōu)勢的。

    下面,我們來重點介紹一下其中一種蛋白質含量測定方法--凱氏定氮法。

凱氏定氮法(Kjedahl法)

首先將濃硫酸倒入樣品中,邊倒邊搖晃,以使?jié)饬蛩崤c樣品充分接觸,然后加熱試劑。如果你需要加快實驗進度,可以加入CuSO4作催化劑,這樣,實驗的反應時間就會大大縮短。CH2COOH和H2SO4反應生成氨氣,然后氨氣又與H2SO4發(fā)生作用,固定了氮元素。這時我們得到了(NH42SO4的溶液,然后我們可以用NaOH去跟硫酸銨反應,通過計算NaOH的使用量,就可以計算出氮的含量。下面是整個定氮法中發(fā)生的化學反應。

    CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3    (1)

    2NH3 + H2SO4= (NH42SO4                       (2)

    (NH42SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3        (3)

       當我們得到氮的含量以后,我們就可以通過一定的計算,zui終算出蛋白質的含量。

       凱氏定氮法常用于有機化合物中的氮含量的測定,是蛋白質含量測定的經典方法,雖然在測試過程中,試劑用量很大,但是,不可否認,它所適用的樣品范圍之廣,測試結果之,都是*的。

       現(xiàn)在,隨著科技的發(fā)展,我們已經研究出帶消化爐的凱氏定氮儀,它把定氮過程中的前兩步驟通過儀器完成,方便了整個過程的實施。凱氏定氮儀能夠自動的對樣品進行消化,然后蒸餾,智能化完成,節(jié)省了時間和精力,提高了工作效率。這種具有有準確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點。浙江托普儀器有限公司提供這種產品,24小時:。

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